Ключевой вопрос в биохимии белков – как белки распознают "верный" партнеры по взаимодействию в море клеточных факторов. Нигде это не является более важным, чем мозг, где взаимодействия, регулирующие активность белков канала, могут изменить поведение организма. Команда биологов из Института биологических исследований Солка недавно расшифровала молекулярный код, который регулирует доступность мозгового канала, который модулирует возбудимость нейронов, – открытие, которое может помочь усилиям по лечению наркомании и психических расстройств.
В раннем онлайн-издании трудов Национальной академии наук в онлайн-выпуске на этой неделе, Пол Слезинджер, доктор философии.D., Доцент Лаборатории пептидной биологии Фонда Клейтона и его коллеги подробно описывают, как регуляторный фактор под названием SNX27 отличает белок канала мозга, называемый GIRK (сокращение от G-протеина, внутренне выпрямляющего калиевые каналы), от структурно схожих белков, а затем направляет его на разрушение.
Эта работа расширяет исследование группы 2007 года, показывающее, что, когда белки SNX27 захватывают каналы GIRK, уменьшая количество каналов в их законных местах назначения, клеточная мембрана. "Нам было любопытно, что определило избирательность этого взаимодействия," говорит Слезингер. "Мы знали, что SNX27 взаимодействует со структурным мотивом, обнаруженным на каналах GIRK, но многие канальные белки демонстрируют аналогичный мотив. Мы хотели узнать, что позволило SNX27 специально выбирать каналы GIRK."
Это очень важно, поскольку каналы GIRK связаны со злоупотреблением психоактивными веществами. Слезинджер и другие показали, что алкоголь или клубные наркотики, связанные с сексуальным насилием (GHB), влияют на функцию канала GIRK в мозгу. Поведение потери ингибирования, связанное со злоупотреблением этими веществами, является результатом того факта, что каналы GIRK позволяют ионам калия просачиваться из стимулированного нейрона, тем самым ослабляя возбудимость клетки.
В новом исследовании команда Слезингера подтвердила, что SNX27 находится в нейронах, чуть ниже мембраны, где находятся активные каналы GIRK. Дополнительные эксперименты с использованием клеток мозга, манипулирующих для экспрессии аномально высоких уровней SNX27, показали, что клетки менее чувствительны к лекарствам, активирующим каналы, что позволяет предположить, что SNX27 проходит через мембраносвязанные GIRK и блокирует их функцию.
Тот факт, что SNX27 отображает общую сигнатуру взаимодействия с белками, называемую доменом PDZ, говорит о том, как SNX27 захватывает своего партнера: GIRK содержат короткую последовательность из 4 остатков, которая связывается с доменами PDZ, мотив узнавания, который Слезингер сравнивает с почтовым индексом. Но каналы, похожие на GIRK, называемые IRK, отображали почти идентичную последовательность, но были невосприимчивы к разрушению SNX27. "Мы были озадачены этим сходством и поменяли код из 4 остатков в IRK на соответствующую последовательность из GIRK," говорит Слезингер. Удивительно, но этот гибрид IRK / GIRK не связывает SNX27, что указывает на отсутствие в IRK других элементов, необходимых для распознавания SNX27.
Чтобы определить эти новые элементы, Слезинджер проконсультировался со своим давним сотрудником, Сеньоном Чоу, Ph.D., профессор лаборатории структурной биологии Солка. Чоу является экспертом в технике, известной как рентгеновская кристаллография, которая используется для определения трехмерной структуры белков. Команда тщательно изучила кристаллизованные формы SNX27, обернутые вокруг связывающего мотива GIRK, чтобы попытаться визуализировать, где белки контактируют.
"Мы наблюдали связывающую щель в PDZ-домене SNX27 и область, которая образовывала еще один карман с большим количеством положительных зарядов," говорит Слезингер. "Фрагмент GIRK, лежащий там, имел отрицательный заряд перед 4-остатком "индекс". Это предполагает, что этот второй сайт допускает ранее неизвестное электростатическое взаимодействие между этими двумя белками." Следовательно, SNX27 может распознавать мотив из 6 остатков, такой как "почтовый индекс плюс 4 ‘код.
Другие эксперименты по обмену, нацеленные на отрицательно заряженную область GIRK, подтвердили гипотезу. Синтетические формы GIRK, лишенные области, больше не связанной с SNX27. Напротив, искусственная версия IRK, разработанная для удержания отрицательных зарядов GIRK, размещенных на SNX27.
Наиболее значимыми были эксперименты, проведенные Бартошем Балана, Ph.D., докторант лаборатории Слезингера и первый автор исследования. Балана измерил токи от ячеек, спроектированных для передачи каналов GIRK, лишенных заряженной области, и обнаружил, что токи GIRK больше не подавлялись SNX27, в то время как клетки, экспрессирующие каналы IRK, отображали ложные GIRK "адрес" теперь ответил на SNX27. "Этот функциональный анализ выявил остатки, которые диктуют связывание SNX27 за пределами нормальной последовательности распознавания PDZ," говорит Бартош. "Это поддерживает модель связывания с двумя сайтами и подчеркивает, что второй сайт может отменять связывание в классическом сайте."
Интересным следствием участия GIRK в поведении, связанном с наркотиками, является то, что уровни SNX27, как сообщается, повышаются в моделях зависимости от стимуляторов, таких как кокаин и метамфетамин, на грызунах. Выборочная блокировка этого недавно выявленного взаимодействия между GIRK и SNX27 может предотвратить зависимость. "Теперь мы можем лучше понять роль этих каналов в реагировании на злоупотребления наркотиками. Мы надеемся, что эта работа приведет к новым стратегиям лечения таких заболеваний, как алкоголизм, или даже болезней возбудимости, таких как эпилепсия." говорит Слезингер.
В исследовании также участвовали Калин Стерн и Лайя Бахима из лаборатории Слезингера и Иннокентий Масленников, а также Витек Квятковски из лаборатории структурной биологии Чоу.