В значительной степени этот высоко отрегулированный процесс экспрессии гена – то, что делает нас полностью функционированием, сложными существами, а не каплей аналогично мыслящих клеток.Несмотря на его важность, исследователи все еще не полностью понимают, как клетки получают доступ к соответствующей информации в ДНК. Они знают, что этим процессом управляют белки, названные транскрипционными факторами, которые связывают с определенными местами вокруг гена, и – в правильной комбинации – позволяют последовательности гена быть прочитанной.Однако функциональных связывающих участков транскрипционного фактора в ДНК общеизвестно трудно определить местонахождение.
Большое количество транскрипционных факторов и типов клетки позволяет бесконечные возможные комбинации, делая его невероятно трудно, чтобы определить, где, когда и как каждое обязательное событие имеет место. Кроме того, следует из усилий по отображению всего генома, только добавили к беспорядку, предложив, чтобы транскрипционные факторы связали очень случайно повсеместно, даже на места, где они не включают или выключают гены.Теперь, исследователи в Институте Stowers Медицинского Исследования разработали метод с высоким разрешением, который может точно и достоверно нанести на карту отдельные связывающие участки транскрипционного фактора в геноме, значительно выиграв у стандартных методов.С новой техникой, которая была издана 9 марта 2015 по своей природе Биотехнология, связывающие участки транскрипционного фактора, которые, вероятно, функциональны, оставляют позади ясные следы, указывая, что транскрипционные факторы последовательно приземляются на очень определенные последовательности.
Напротив, сомнительные связывающие участки, которые были ранее обнаружены, как связано, показали более рассеянный неопределенный образец, который больше не считали связанным.«Теперь мы видим тонкость и уровень точности, которую мы не ожидали», говорит Штоверс Асзоциате Инвестигатор Юлия Цайтлингер, доктор философии, ведущий автор исследования, которое также включало коллег Штоверс Киая Хэ, доктора философии, и Джеффа Джонстона. «Не только делают мы видим отличный мотив последовательности, где транскрипционный фактор связывает, но мы также видим дополнительные последовательности, которые, кажется, способствуют обязательной специфике.
Есть намного больше информации, которую мы можем теперь прочитать, чтобы понять, как эти факторы действуют на генетический код, чтобы влиять на выражение».За прошлые 15 лет много методов появились, чтобы позволить исследователям нанести на карту, где транскрипционные факторы связывают с геномом.
Все эти методы основываются на методе, названном хроматином immunoprecipitation или ChIP, который по существу ограничивает белки их позициями по ДНК, раскалывает ДНК в управляемые куски, и затем изолирует разделы, которые связаны белками.Исследователи проявили множество подходов, чтобы определить последовательность, содержавшую в этих разделах. Чип ЧИПА использует микромножества или технологию ДНК чипа, чтобы найти общий район, где след транскрипционного фактора появился.
ЧИП-seq улучшает этот подход при помощи последних упорядочивающих технологий, но все еще не может точно определить точный адрес следа.Прорыв шел с ЧИПОМ-exo, разработанным Франком Пью, доктором философии и коллегами в Университете Государственного университета Пенсильвании, который использует добавление фермента, названного экзонуклеазой, чтобы урезать назад фрагменты ДНК к пятну, где транскрипционный фактор связан. Хотя эта последняя техника обещала показать точный адрес каждого транскрипционного фактора, его практическое внедрение потерпело неудачу.После нескольких попыток заставить метод ЧИПА-exo работать в ее лаборатории, Цайтлингер решил развивать ее собственную версию.
Работая с чипом ЧИПА или ЧИПОМ-seq больше 15 лет, Цайтлингер признал, что намного меньшие количества DNA, полученной ЧИПОМ-exo, сделали его очень трудно, чтобы получить точную информацию о последовательности. Помогая студентке, работающей над несвязанным методом РНК, она видела потенциальное решение.
Обычно, когда исследователи готовят полосу ДНК для анализа, они должны добавить дополнительную часть последовательности, которая служит своего рода создавала сайт для упорядочивающего оборудования. Традиционно, это приготовительное включает два неэффективных шага «лигатуры», добавляя немного последовательности сначала к фронту и затем к задней части каждого образца.Zeitlinger и ее коллеги выяснили способ достигнуть того же самого подвига во всего одном шаге лигатуры, добавив немного последовательности к задней части фрагмента и затем позволив берегу сформировать круг. Кроме того, исследователи включали случайный штрихкод в часть ДНК, которую они использовали для лигатуры, которая позволила им зафиксировать любые ошибки или экспонаты, которые могли бы возникнуть в упорядочивающей процедуре.
Они назвали новый метод «экспериментами ChIP с резолюцией нуклеотида через экзонуклеазу, уникальный штрихкод и единственную лигатуру» или связь ЧИПА. Когда они использовали связь ЧИПА, чтобы нанести на карту следы четырех известных белков – а именно, человеческий TBP и Дрозофила NF-kappaB, Твист и Макс – они нашли, что это последовательно выигрывало у существующих протоколов ЧИПА-seq в резолюции и специфике.
Новый инструмент мог отличить реальные следы, произведенные транскрипционным фактором, выжидающим на конкретной последовательности в течение долгого времени, от фонового шума, который, возможно, явился результатом белка, делающего паузу на последовательности в ее поиске правильного пятна приземления. Наличие лучшей коллекции реальных следов в свою очередь предоставляет намного более подробную информацию о последовательности об обязательных предпочтениях транскрипционных факторов.Цайтлингер думает, что техника представляет важный шаг вперед для области и в конечном счете вытеснит ЧИП-seq для исследования регуляции генов.«У нас все еще есть очень упрощенная идея того, как транскрипционные факторы входят, открывают ДНК и включают гены», говорит Цайтлингер. «Если мы сделаем этот вид анализа для большого количества транскрипционных факторов, мы соберем информацию, должен был лучше понять экспрессию гена».
В частности, она хотела бы видеть, что техника раньше спрашивала, как небольшие изменения в ДНК – виде, которые существуют естественно в народонаселении – затрагивают закрепление транскрипционного фактора и поэтому различия в экспрессии гена от одного человека к следующему.Работа финансировалась Институтом Stowers Медицинского Исследования и гранта от Национальных Институтов Здоровья (Новая Премия Новатора 1DP2OD004561). Содержание – только ответственность авторов и не обязательно представляет официальные представления о NIH.
Положите резюме результатовВ любой момент времени, только подмножество генов в данной клетке выражены или «включены».
Протейнс назвал акт транскрипционных факторов как молекулярные телефонистки клетки, обязав определенные места в ДНК щелкнуть различными генами на и прочь. Несмотря на их важность, исследователи все еще испытывают затруднения при идентификации этих связывающих участков транскрипционного фактора. В текущем номере научного журнала Nature Biotechnology ученые Института Штоверс сообщают о разработке нового метода под названием связь ЧИПА, которая может точно и достоверно нанести на карту эти места, значительно выиграв у предыдущих методов.
Штоверс Асзоциате Инвестигатор Юлия Цайтлингер, доктор философии, который привел исследование, объясняет, что исследователи могут использовать новый метод, чтобы понять, как транскрипционные факторы взаимодействуют с ДНК, чтобы управлять экспрессией гена. Например, запатентованная техника уже показала, что связывающие участки транскрипционных факторов не рассеяны через геном, как ранее думается, а скорее появляются в определенных, предсказуемых последовательностях.