Новый метод отображения основывается на технике, названной микроскопией единственной молекулы, добавляя информацию об ориентации и движении флуоресцентных красок, приложенных к нити ДНК.В. Э. Моернер, Стэнфордский университет, США, является основателем спектроскопии единственной молекулы, впечатляющий метод с 1989, который позволил ученым визуализировать единственные молекулы с оптической микроскопией впервые. Из нобелевских лауреатов 2014 года для оптической микроскопии вне предела дифракции (Moerner, Hell & Betzig) Моернер и Бециг привыкли единственные молекулы для изображения плотное множество молекул в разное время.
В журнале Оптического Общества для высокого исследования воздействия, Optica, исследовательская группа во главе с Моернером описывает их новую технику и демонстрирует его, получая изображения суперрезолюции и измерения ориентации для тысяч единственных флуоресцентных молекул краски, приложенных к нитям ДНК.«Вы можете думать об этих новых измерениях как об обеспечении небольших двуглавых стрел, которые показывают ориентацию молекул, приложенных вдоль нити ДНК», сказал Моернер. «Эта информация об ориентации сообщает о местной структуре оснований ДНК, потому что они ограничивают молекулу. Если бы у нас не было этой информации об ориентации, то изображение просто было бы местом».Добавление более наноразмерной информации
Берег ДНК – очень длинная, но узкая последовательность, всего несколько миллимикронов через. Микроскопия единственной молекулы, вместе с флуоресцентными красками, которые свойственны ДНК, может использоваться, чтобы лучше визуализировать эту крошечную последовательность. До сих пор было трудно понять, как те краски были ориентированы и невозможны знать, была ли флуоресцентная краска присоединена к ДНК твердым или несколько свободным способом.Адам С. Бэкер, первый автор статьи, развивал довольно простой способ получить ориентацию и вращательную динамику от тысяч единственных молекул параллельно. «Наш новый метод отображения исследует, как каждая отдельная молекула краски, маркирующая ДНК, выровнена относительно намного большей структуры ДНК», сказал Бэкер. «Мы также имеем размеры, насколько шаткий каждая из этих молекул, который может сказать нам, застревает ли эта молекула в одном конкретном выравнивании или шлепает ли это в течение нашей последовательности измерения».
Новая техника предлагает более подробную информацию, чем сегодняшние так называемые методы «ансамбля», которые составляют в среднем ориентации для группы молекул, и это намного быстрее, чем софокусные методы микроскопии, которые анализируют одну молекулу за один раз. Новый метод может даже использоваться для молекул, которые относительно тусклы.Поскольку техника предоставляет наноразмерную информацию о самой ДНК, это могло быть полезно для наблюдения изменений структуры ДНК или повреждения конкретной области ДНК, которая обнаружится как изменения в ориентации молекул краски.
Это могло также использоваться, чтобы контролировать взаимодействия между ДНК и белками, которые стимулируют много клеточных процессов.30 000 ориентаций единственной молекулы
Исследователи проверили расширенный метод отображения ДНК при помощи его, чтобы проанализировать вставляющуюся краску; тип флуоресцентной краски, которая скользит в области между основаниями ДНК. В типичном эксперименте отображения они приобретают до 300 000 единственных мест молекулы и 30 000 измерений ориентации единственной молекулы за чуть более чем 13 минут. Анализ показал, что отдельные молекулы краски были ориентированы на перпендикуляр на ось нити ДНК и что, в то время как молекулы имели тенденцию ориентироваться в этом перпендикулярном направлении, они также переместились в ограниченном конусе.
Следователи затем выполнили подобный анализ, используя другой тип флуоресцентной краски, которая состоит из двух частей: одна часть, которая свойственна стороне ДНК и флуоресцентной части, которая связана через гибкую привязь. Расширенный метод отображения ДНК обнаружил эту гибкость, показав, что метод мог быть полезным в помощи ученым понять на молекуле основанием молекулы, свойственны ли различные этикетки ДНК мобильным или фиксированным способом.
В газете исследователи продемонстрировали пространственное разрешение приблизительно 25 миллимикронов и измерения ориентации единственной молекулы с точностью до приблизительно 5 градусов. Они также измерили вращательную динамику или гибкость, единственных молекул с точностью до приблизительно 20 градусов.Как это работаетЧтобы приобрести информацию об ориентации единственной молекулы, исследователи использовали хорошо изученную технику, которая добавляет оптический элемент, названный электрооптическим модулятором к микроскопу единственной молекулы.
Для каждой рамы камеры изменилось это устройство, поляризация лазерного света раньше освещала все флуоресцентные краски.Так как флуоресцентные молекулы краски с ориентациями, наиболее тесно выровненными с поляризацией лазерного света, будут казаться самыми яркими, измерять яркость каждой молекулы в каждой раме камеры позволило исследователям определять количество ориентации и вращательной динамики на основе молекулы молекулой.
Молекулы, которые переключились между ярким и темным в последовательных структурах, были твердо ограничены при конкретной ориентации, в то время как те, которые казались яркими для последовательных структур, твердо не держали их ориентацию.«Если у кого-то есть микроскоп единственной молекулы, они могут выполнить нашу технику довольно легко, добавив электрооптический модулятор», сказал Покровитель. «Мы использовали довольно стандартные инструменты немного отличающимся способом и проанализировали данные по-новому, чтобы получить дополнительное биологическое и физическое понимание».