Путем перепрофилирования лекарств группа исследователей под руководством биологов-животных из Университета Нагои обнаружила соединения, которые могут либо сокращать, либо удлинять циркадный ритм в клетках человека. Стероидный гормон дегидроэпиандростерон (ДГЭА), также известный как обычная антивозрастная добавка, продемонстрировал активность по сокращению периода, а когда его давали мышам, симптомы смены часовых поясов значительно уменьшились. Дальнейший скрининг известных биологически активных соединений может привести к открытию других эффективных соединений, которые могут лечить нарушения циркадных часов, возникающие в результате смены часовых поясов и сменной работы. Эксперименты проводились в рамках совместного исследовательского сотрудничества между исследователями ITbM, Национального института фундаментальной биологии, Медицинского университета префектуры Киото и Университета Киндай.
Согласно исследованию, опубликованному в EMBO Molecular Medicine, группа использовала высокопроизводительный химический скрининг существующих лекарств и биоактивных соединений, чтобы изучить их влияние на циркадные ритмы. Исследователи определили различные хитовые соединения, которые могут регулировать циркадный ритм в клетках человека, в том числе хорошо известную антивозрастную добавку, которая способна уменьшить смену часовых поясов у мышей.
Многие часто летающие люди, путешествующие через часовые пояса, страдают от смены часовых поясов, что вызвано несоответствием между внешними временными сигналами (смещенный дневной / ночной цикл) и их биологическими (циркадными) часами. Циркадные часы у людей имеют примерно 24-часовой ритм, и циркадный ритм играет важную роль в регулировании циклов сна / бодрствования, секреции гормонов и метаболизма. Следовательно, хроническое нарушение циркадного ритма из-за смены часовых поясов или сменной работы (циркадная десинхрония) может привести к нарушениям сна, ожирению и повышенному риску рака в долгосрочной перспективе.
Хотя нарушение биоритма обычно вызывает ряд нежелательных симптомов, эффективных лекарств или добавок для его лечения остается мало. Большинство лекарств, которые циркадные биологи обнаружили для уменьшения смены часовых поясов у мышей, требуют инъекции в определенную область мозга, что не очень практично. Такаши Йошимура, биолог и профессор ITbM Университета Нагоя, решил использовать стратегию перепрофилирования лекарств, метод определения новых функций для существующих биологически активных соединений. Он искал соединения, которые могут регулировать циркадные часы и могут быть полезны для лечения смены часовых поясов.
Разработка новых фармацевтических препаратов обычно требует больших затрат времени и средств, о чем свидетельствуют данные, показывающие, что одно лекарство стоит миллиарды долларов и в среднем до выхода на рынок требуется от 13 до 15 лет. Поэтому перепрофилирование лекарств – популярный подход к разработке новых лекарств. Известные примеры перепрофилирования лекарств включают переработку миноксидила, первоначально выпущенного на рынок как сосудорасширяющее средство, предназначенное для роста волос, а также силденафил, гипотензивное средство, перепрофилированное для лечения эректильной дисфункции и продаваемое как Виагра.
"В 2015 году мы сообщили о синтезе молекулы с продемонстрированной активностью по сокращению периода на циркадных часах млекопитающих, обнаруженной в результате сотрудничества хронобиологов ITbM, химиков-синтетиков и ученых-теоретиков," говорит Ёсимура. "К сожалению, это соединение было довольно токсичным, что заставило меня больше задуматься о безопасности молекул. Затем я подумал, что перепрофилирование лекарств было бы лучшим подходом для определения соединений, которые можно было бы использовать для лечения смены часовых поясов, поскольку токсичность и способ действия существующих лекарств уже были бы исследованы."
Исследовательская группа провела высокопроизводительный скрининг более 1000 соединений, состоящих из существующих лекарств, в том числе одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, Европы или Азии, а также лекарств, находящихся в клинических испытаниях, для поиска лекарств, которые могут регулировать циркадный ритм. ритм у млекопитающих.
Исследования циркадных часов продолжаются в течение многих десятилетий и привели к открытию молекулярных механизмов, контролирующих циркадный ритм, за что в 2017 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. Почти все клетки содержат циркадные часы, контролируемые центральным кардиостимулятором, расположенным в гипоталамусе головного мозга. Циркадные часы, содержащиеся в большинстве тканей и клеток, управляются петлями транскрипционно-трансляционной обратной связи, состоящими из генов и белков циркадных часов.
Два тактовых белка, белок капут (CLOCK) и Arnt-like1 мозга и мышц (BMAL1), связываются друг с другом, образуя гетеродимерный комплекс, который затем связывается с последовательностью ДНК, называемой E-box (CACGTG), расположенной в верхняя область часовых генов Period (Per) и Cryptochrome (Cry), присутствующих в геноме. Это активирует транскрипцию и трансляцию генов Per и Cry, что приводит к генерации часовых белков PER и CRY. Белки PER и CRY образуют димер, который затем ингибирует их активаторы транскрипции, CLOCK и BMAL1. Активация и ингибирование часовыми генами и белками составляет петлю транскрипционно-трансляционной обратной связи, которая завершает цикл один раз в день, создавая, таким образом, 24-часовой циркадный ритм в различных физиологических и поведенческих процессах.
Исследовательская группа провела скрининг различных библиотек лекарств, настроив систему, в которой они наблюдали ежедневную транскрипцию часового гена Bmal1 посредством мониторинга биолюминесцентного ритма с использованием гена биолюминесценции (люциферазы) светлячка. Каждое лекарство добавляли в 384-луночный планшет, содержащий клетки человека (U2OS), трансфицированные геном люциферазы.
В результате высокопроизводительного скрининга более 1000 существующих лекарств команда обнаружила 59 хитовых соединений, влияющих на биолюминесцентный ритм. Среди этих препаратов 46 соединений удлиняли циркадный период, а 13 соединений сокращали его. Эти хитовые соединения содержат биоактивные молекулы, которые используются в качестве противораковых, антибактериальных и противозачаточных средств, гормонов, витаминов, а также для лечения заболеваний, связанных с центральной нервной системой, пищеварительной системой, сердцем и кожей. Результаты их исследований показывают, что примерно 5 процентов лекарств, имеющихся в настоящее время на рынке, могут оказывать некоторое влияние на наши циркадные ритмы, в зависимости от их дозы и продолжительности приема.
"Я был очень взволнован, когда обнаружил хитовые соединения, которые меняли период действия на человеческие клетки, и хотел немедленно протестировать их на мышах, чтобы увидеть, могут ли препараты облегчить симптомы смены часовых поясов," говорит Ёсимура. "Однако многие члены нашей группы колебались, поскольку считали, что эффекты, наблюдаемые в клетках, слишком малы, но я не сомневался, что результаты будут переведены с клеточного уровня (in vitro) на уровень животных (in vivo)."
Для большинства путешественников, летящих на запад (e.грамм. из Азии в Европу), который задерживает циркадные часы, не вызывает особых проблем со здоровьем. С другой стороны, летя на восток (e.грамм. из Азии в Америку), который ускоряет циркадные часы, заставляет людей просыпаться раньше, чем обычно, и имеет тенденцию вызывать серьезные симптомы смены часовых поясов, такие как усталость и бессонница. Поэтому Йошимура и его группа решили исследовать соединения, сокращающие циркадный цикл, которые ускоряют циркадные часы и облегчают симптомы смены часовых поясов при путешествии на восток.
Среди 13 соединений, сокращающих циркадный цикл, которые идентифицировала группа, исследователи сосредоточились на стероидном гормоне дегидроэпиандростероне (DHEA), который коммерчески доступен в качестве антивозрастной добавки в США. У людей DHEA вырабатывается в надпочечниках, гонадах и головном мозге и является предшественником тестостерона и эстрогена. ДГЭА – один из наиболее распространенных гормонов, циркулирующих в кровотоке, но его концентрация обычно снижается с возрастом. Вот почему DHEA продается как добавка для борьбы со старением и для ускорения метаболизма.
Дальнейшие исследования показали, что DHEA сокращает период циркадных часов в культивируемых клетках человека дозозависимым образом. Команда обнаружила, что DHEA ускоряет циркадный ритм в клетках человека, а также в культивируемых клетках и тканях мышей. Поскольку предыдущие исследования продемонстрировали безопасность перорального введения ДГЭА мышам, были проведены эксперименты, чтобы проверить, влияет ли ДГЭА на циркадный ритм мышей.
"Когда мы скармливали мышам DHEA, смешанный с порошковой пищей, мы были удивлены и обрадованы, обнаружив, что DHEA сокращает циркадный период у мышей," говорит Кэтрин Тамай, научный сотрудник группы профессора Йошимуры, которая в основном проводила эксперименты. "Затем мы провели эксперимент по смене часовых поясов, в котором мы поместили мышей в свет / темноту, а затем продлили цикл на 6 часов, что похоже на временной сдвиг, возникающий при путешествии из Японии на Аляску. Мыши с реактивной задержкой, которых кормили DHEA, по-видимому, восстанавливались и адаптировались к новому часовому поясу быстрее, чем мыши, которых кормили обычной пищей. В среднем мыши, получавшие DHEA, восстанавливались после смены часовых поясов примерно за два-три дня, тогда как мышам без DHEA потребовалось примерно пять-шесть дней, чтобы их деятельность адаптировалась к новому циклу свет / темнота," она описывает.
"Я начал это исследование в 2016 году, и, будучи биологом, который работал в основном с рыбами, я сначала боялся тестировать лекарства на мышах, но профессор Йошимура был очень оптимистичен и уверен, что этот эксперимент сработает, и его настойчивость окупилась," говорит Тамай.
Кажется, что простое решение состоит в том, чтобы принять DHEA, чтобы вылечить смену часовых поясов, но одна важная проблема заключается в том, что уровни циркулирующего DHEA у мышей и людей различаются. Причина, по которой DHEA мог быть настолько эффективным у мышей, может заключаться в том, что начальная циркулирующая концентрация DHEA значительно ниже у мышей (примерно 15 процентов) по сравнению с людьми. Кроме того, чрезвычайно высокие дозы DHEA фактически привели к удлинению циркадного периода. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить фактическую эффективность ДГЭА для лечения смены часовых поясов у людей.
"Наши исследования показали, что ДГЭА, вероятно, действует в первую очередь на периферические циркадные часы, а не на главные часы в центральной нервной системе, которая контролирует часы во всем организме," объясняет Ёсимура. "Чтобы полностью уменьшить смену часовых поясов, необходимо отрегулировать как центральные, так и периферические циркадные часы. Мы предполагаем, что ДГЭА может быть эффективным при приеме вместе с другим лекарством, которое действует на центральные циркадные часы."
Используя перепрофилирование лекарств, группа Йошимуры не только определила препараты, изменяющие циркадный ритм, но также смогла идентифицировать гены, которые участвуют в регуляции циркадных часов. Группа определила несколько ингибиторов тирозинкиназы, влияющих на циркадные ритмы, и обнаружила доказательства, свидетельствующие о том, что протеинкиназы мышиного лейкоза Абельсона (ABL) и зоны разрыва (BCR) участвуют в регуляции циркадных часов млекопитающих. Тирозин – это аминокислота, присутствующая в белках, которые содержат гидроксильную группу, а киназы – это ферменты, которые катализируют фосфорилирование (добавление фосфатной группы) различных субстратов в клетке. Гидроксильные, аминные и карбоксильные фрагменты в белках могут быть фосфорилированы, что модифицирует белки, чтобы включать или выключать их для различных функций.
Предыдущие отчеты показали, что в генетической аномалии, называемой филадельфийской хромосомой, слияние генов ABL и BCR вызывает лейкемию. Однако точная роль этих генов в нормальном состоянии осталась неизвестной, поскольку генетический нокаут этих генов является летальным. Группа Йошимуры провела скрининг существующих лекарств, чтобы обнаружить, что эти ферменты фосфорилирования, возникающие из генов ABL и BCR, участвуют в регуляции циркадных часов, тем самым доказав, что химико-генетические подходы полезны для исследования циркадных часов.
"В настоящее время мы расширяем наши химические библиотеки и в настоящее время изучаем пищевые добавки и натуральные продукты, чтобы найти соединения, которые могут регулировать циркадный ритм у людей," говорит Ёсимура. "Мы надеемся разработать и сможем предоставить новые и безопасные соединения, которые можно принимать перорально для лечения смены часовых поясов."